Introducción

La medicina herbolaria se refiere al uso de extractos de plantas medicinales o sus derivados con fines terapéuticos para la prevención y tratamiento de diversas enfermedades a través de su empleo. El hombre desde el principio de los tiempos, ha hecho lo posible por atenuar sus enfermedades y mejorar su calidad de vida y la medicina herbolaria ha jugado un papel muy importante en esto¹. En muchos países, la cobertura para la atención odontológica no se ha alcanzado en su totalidad, por eso se ha formalizado el uso de la medicina tradicional, entre ellos la fitoterapia ya que es un recurso accesible para gran parte de la población². Las plantas y los productos naturales han sido empleados a través de la historia, algunas veces con resultados terapéuticos favorables, pero también ocurrían en ese tiempo, una gran cantidad de envenenamientos, es por eso muy importante conocer la toxicidad de las plantas y realizar pruebas que permitan evaluar mediante ensayos su seguridad³. Aproximadamente la mitad de los productos farmacéuticos a base de plantas que se fabrican en los Estados Unidos son indicados para su uso como antimicrobianos. Existen aproximadamente entre 250,000 y 500,000 especies de plantas en el mundo, pero sólo entre el 1 al 10% de ellas, son usadas como comida tanto por humanos como por animales.

En Estados Unidos, el uso de plantas medicinales viene de los nativos americanos y de los migrantes europeos que llegaron ahí en el siglo 19. Las plantas tienen sustancias aromáticas como los fenoles, terpenoides, quinonas y taninos que son metabolitos secundarios que pueden ser efectivos contra virus, bacterias y hongos⁴. En odontología, las plantas representan una alternativa en el descubrimiento de nuevas funciones de las mismas y de sus compuestos químicos contra enfermedades orales.

El Tepezcohuite (Mimosa tenuiflora) fue descrita por Wild en 1810, también llamado árbol de la piel es una especie arbustiva localizada abundantemente en la región central de Chiapas e Istmo de Tehuantepec, Oaxaca, México; es ampliamente usada en ramoneo de ganado ovino y caprino y se le atribuyen cualidades de cicatrización de la piel por quemaduras de sol, exposición accidental al fuego, úlceras estomacales y uso en cosméticos. Se han fabricado productos artesanales e industrializados a partir de su corteza contra heridas y quemaduras de la piel que han sido muy populares desde los años ochenta⁵.

Equisetum arvense o cola de caballo fue descrita por Carlos Linneo en 1753, es una planta primitiva, descendiente de los enormes árboles del paleozoico. El nombre del género, Equisetum, deriva del latín: equus (caballo) y seta (crin). Una de las propiedades que hacen única a esta planta es su alto contenido en sales de sílice, algunas de ellas hidrosolubles. Este mineral es indispensable en la formación de tejido conectivo, uñas y huesos, además se considera que acelera la regeneración del tejido conectivo dañado.

El equiseto se encuentra distribuido por las zonas templadas del hemisferio septentrional y se han identificado dos quimiotipos, uno en Europa y otro en Asia y América del Norte que se pueden distinguir químicamente de flavonoides los cuales caracterizan a esta planta⁶. El clavo de olor o Syzygium aromaticum, también conocido como Eugenia caryophyllata fue descrito por L. Merr y L. M. Perry en 1929 y es una especia ampliamente usada y conocida, su aceite esencial y extractos han sido analizados y caracterizados debido a que han demostrado tener amplio espectro de acción contra una gran variedad de microorganismos que causan distintos padecimientos que afectan a los humanos, animales y plantas.

El clavo de olor es una especia perteneciente a la familia Myrtaceae, la cual se caracteriza por habitar en ambientes principalmente tropicales⁷. Otra especia de gran valor es el orégano que fue descrito por Kunth en 1818, es una planta herbácea arbustiva comúnmente utilizada con propósitos culinarios⁸. En el planeta existen diferentes especies conocidas como orégano y las de mayor importancia económica son orégano griego (Origanum migare), orégano español (Coridohymus capitatus), orégano turco (Origanum onites) y orégano mexicano (Lippia graveolens). Una planta de gran interés es el Aloe vera, ya que posee muchos usos en las industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética; fue descrita por Carlos Linneo en 1753 y una de las partes más utilizadas de esta planta es el gel debido a sus propiedades funcionales, antioxidantes y terapéuuticas. El A. vera o sábila es una planta la cual presenta alrededor de 360 especies diferentes y pertenece a la familia de las asfodeláceas o liláceas, con hojas perennes en forma de roseta; su tamaño puede alcanzar desde unos cuantos centímetros hasta los 50 cm⁹. Las pruebas que determinan la susceptibilidad de un microorganismo frente a plantas o a los medicamentos antimicrobianos a partir de la exposición de una concentración estandarizada del germen a estos fármacos se denominan pruebas de sensibilidad, también llamadas antibiogramas. Pueden realizarse para bacterias, hongos o virus. El estudio de susceptibilidad in vitro a antimicrobianos de los microorganismos patógenos puede realizarse a través de diversos métodos, el de uso más común por los laboratorios de microbiología es el de difusión en agar estandarizado para microorganismos de crecimiento rápido. El método estandarizado y recomendado se basa en el descrito originalmente por Bauer, llamado también de sensibilidad en disco, que obtiene resultados cualitativos que se correlacionan bien con los resultados cuantitativos obtenidos mediante determinación de halos de inhibición¹⁰. El Streptococcus mutans es uno de los microorganismos cariogénicos asociados a la caries dental, de acuerdo con la hipótesis de la placa ecológica, la caries dental es la consecuencia de un desbalance natural de la microflora oral ocasionada porque se alteran las condiciones ambientales locales. Es muy importante el estudio de su participación en la colonización de tejidos dentales, implantación e interacción con otros microrganismos para la comprensión de la dinámica de las biopelículas dentales¹¹. El Streptococcus sobrinus es una variedad de S. viridans, esta bacteria vive en la flora de la boca humana y además del Streptococcus mutans, es uno de los causantes de la caries dental humana. El S. sobrinus, tiene un número menor de sistemas de señalización de dos componentes y genes relacionados con la bacteriocina que S. mutans, pero todas o incluso más proteínas inmunitarias. Ambas especies muestran diferencias considerables en la regulación del catabolismo de fructanos, sin embargo, tanto S. mutans como S. sobrinus comparten la mayoría de estos rasgos y, por lo tanto, deben considerarse igualmente virulentos con respecto a la caries dental. La caries y las enfermedades de la pulpa representan un problema de salud pública importante. Algunas plantas contienen sustancias que se conocen como metabolitos y que son de tipo alcaloides, cumarinas, fenoles, flavonoides, saponinas, etc. que han demostrado presentar acción antimicrobiana cotra diferentes bacterias, otras pueden inhibir o aumentar la actividad antiagregante de las plaquetas o la coagulación de la sangre lo que en odontología representa una alternativa para evaluar su impacto contra enfermedades orales, por lo tanto, es muy importante realizar una evaluación de las propiedades de cada producto vegetal¹². El objetivo de este estudio fue la evaluación antimicrobiana y coagulante de los extractos de cinco vegetales de interés etnobotánico (Mimosa tenuiflora, Equisetum arvense, Syzygium aromaticum, Lippia graveolens y Aloe vera).

Materiales y métodos

Es un estudio comparativo, abierto, experimental, prospectivo y transversal para realizar la evaluación antimicrobiana y coagulante de extractos de cinco vegetales. El material vegetal utilizado en este estudio fue obtenido de lugares reconocidos para su venta, recolectadas y autentificadas por el Dr. Mauricio González Ferrara. Se obtuvieron las plantas M. tenuiflora (tepezcohuite), E. arvense (cola de caballo), S. aromaticum (clavo) y L. graveolens (orégano) Posteriormente, el material vegetal seco y molido se colocó en diferentes soxhlet y se adicionaron 500 mL del solvente etanol durante 72 horas. Se eliminó el solvente mediante un rotoevaporador a presión reducida y se filtró y se llevó a sequedad para obtener los rendimientos. Para obtener el liofilizado de sábila primero se obtuvo el extracto acuoso de A. vera, 250 g de la pulpa fueron macerados obteniendo el gel para posteriormente, filtrarse, congelarse y obtener el liofilizado. Los extractos fueron colocados en frasco ámbar estéril a temperatura de 4ºC para su conservación y posteriormente se fabricaron las concentraciones de 500 y 1000 ppm con las diferentes plantas y en cada ensayo se respetó el siguiente orden metodológico M. Tenuiflora (1), E. Arvense (2), S. aromaticum (3), L. graveolens (4), y A. vera (5).Primeramente se evaluó la actividad antimicrobiana de los extractos contra cepas bacterianas de S. mutans (ATCC700611) y S. sobrinus (ATCC33478) procedentes del Centro de Investigación y Desarrollo en Ciencias de la Salud (CIDICS) UANL. Los estudios experimentales in vitro se realizaron con cepas procedentes de la American Type Culture Collection y fueron elegidas por ser consideradas como los principales microorganismos causantes de la caries y las patologías pulpares entre las que destaca la pulpitis. La evaluación de la actividad antimicrobiana se realizó mediante prueba de técnica de pozo en agar. Se preparó inicialmente una suspensión de microorganismos a 0.05 de la escala de Mc Farland, lo cual representa 1x10⁶ UFC/mL y se evaluaron concentraciones de 500 y 1000 ppm de cada extracto. Se inocularon y sembraron 100μL de cada cepa sobre medio de cultivo Muller Hinton empleando la técnica de pozo en agar para probar si los extractos presentaban actividad antimicrobiana. Se realizaron cinco pozos en el agar y se adicionarán 20μL de cada extracto a evaluar y como control positivo clorhexidina al 0.12% (1200ppm). Las cajas fueron incubadas a 37ºC durante 24 horas para evaluar posteriormente la actividad. La actividad coagulante de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens y A. vera se analizó mediante pruebas de coagulación para verificar su potencial para inhibir la actividad antiagregante de las plaquetas.

Se midieron los tiempos TP (tiempo de protrombina) y TTPa (tiempo de tromboplastina parcial activado) verificando el comportamiento de los extractos a 500 y 1000 ppm en muestras de sangre venosa humana previa selección del paciente y verificando que cumplíera con las condiciones para la prueba. Previo consentimiento del comité de bioética de la UANL se identificó al paciente, se le pidió que firmara la hoja de consentimiento informado para la toma y procesamiento de muestra, se extrajeron muestras de sangre venosa periférica del donante con tiempos de coagulación dentro del rango normal utilizando tubos de 4.5 mL (Vacutainer®) conteniendo citrato de sodio al 3.2% para la anticoagulación según las técnicas de hematología del laboratorio y los protocolos establecidos, posteriormente se enviaron las muestras al laboratorio certificado para obtener los resultados. La prueba se realizó mediante coagulómetro, los resultados se expresan en segundos y el instrumento marca exactamente el momento en el que se produce el coágulo, para todas las concentraciones se procede de la misma manera verificando por triplicado.

Resultados

Las siguientes figuras muestran la media de los halos de inhibición de los diferentes extractos en concentraciones de 500 y 1000 ppm contra S. mutans . S. sobrinus comparando con el control positivo que fue clorhexidina al 0.12% (1200 ppm) la cual se eligió por ser utilizada en odontología como antimicrobiano en el manejo clínico. Se consideró significación estadística una .<0.05.

La figura 1 muestra la actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens . A. vera sobre cepas de S. mutans a 500 ppm en donde se observa una diferencia estadística altamente significativa de los extractos de E. arvense y L. graveolens (p=0.0057) y (p=0.0000) respectivamente, los cuales mostraron un efecto antimicrobiano superior a clorhexidina.

Figura 1. Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens, y A. vera sobre cepas de S. mutans. Concentración 500 ppm. Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes.

Figura 1
Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M tenuiflora E arvense S aromaticum L graveolens y A vera sobre cepas de S mutans Concentración 500 ppm Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

La figura 2 muestra la actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens . A. vera sobre cepas de S. mutans a 1000 ppm en donde se observa una diferencia estadística altamente significativa de los extractos de E. arvense y L. graveolens (p= 0.0001) los cuales mostraron un efecto antimicrobiano superior a clorhexidina.

Figura 2. Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens, y A. vera sobre cepas de S. mutans. Concentración 1000 ppm. Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes.

Figura 2
Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M tenuiflora E arvense S aromaticum L graveolens y A vera sobre cepas de S mutans Concentración 1000 ppm Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

La figura 3 muestra la actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens . A. vera sobre cepas de S. sobrinus a 500 ppm en donde se observa una diferencia estadística altamente significativa de los extractos de A. vera (p= 0.0011) y L. graveolens (p=0.0089), los cuales mostraron un efecto antimicrobiano superior a clorhexidina.

Figura 3. Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens, y A. vera sobre cepas de S. sobrinus. Concentración 500 ppm. Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes.

Figura 3
Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M tenuiflora E arvense S aromaticum L graveolens y A vera sobre cepas de S sobrinus Concentración 500 ppm Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

La figura 4 muestra la actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens . A. vera sobre cepas de S. sobrinus a 1000 ppm en donde se observa una diferencia estadística altamente significativa de los extractos de A. vera (p=0.0127) y L. graveolens (p=0.0006), los cuales mostraron un efecto antimicrobiano superior a clorhexidina.

Figura 4. Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M. tenuiflora, E. arvense, S. aromaticum, L. graveolens, y A. vera sobre cepas de S. sobrinus. Concentración 1000 ppm. Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes.

Figura 4
Actividad antimicrobiana de los extractos de las plantas de M tenuiflora E arvense S aromaticum L graveolens y A vera sobre cepas de S sobrinus Concentración 1000 ppm Las barras representan el promedio del triplicado de tres ensayos totalmente independientes
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

En cuanto a los resultados de las pruebas de coagulación la figura 5 muestra la evaluación in vitro del tiempo de protrombina (TP) de los extractos de M. tenuiflora, E. arvense, A. vera, S. aromaticum y L. graveolens en concentraciones de 1000 y 500 ppm. Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano. Observamos que el valor de TP del paciente es 12.27 segundos, todos los extractos se comportaron dentro de los rangos esperados puesto que no se observó diferencia estadística con un valor de (p<0.05) sin embargo, E. arvense y S. aromaticum ambos a 1000 ppm presentaron tiempos aumentados de 13.37 segundos.

Figura 5. Evaluación in vitro del tiempo de protrombina (TP) de los extractos de M. tenuiflora (Mt), E. arvense (Ea), A. vera (Av), S. aromaticum (Sa) y L. graveolens (Lg) a 500 y 1000 ppm. Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano.

Figura 5
Evaluación in vitro del tiempo de protrombina TP de los extractos de M tenuiflora Mt E arvense Ea A vera Av S aromaticum Sa y L graveolens Lg a 500 y 1000 ppm Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

La figura 6 muestra la evaluación in vitro del tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa) de los extractos de M. tenuiflora, E. arvense, A. vera, S. aromaticum y L. graveolens. Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano. Observamos que el valor de TPPa del paciente es 32.63 seg, no se observó diferencia estadística con un valor de (p<0.05) sin embargo, M. tenuiflora a 500 ppm con un valor (p<0.05) aumentó los tiempos a 39.17 segundos.

Figura 6. Evaluación in vitro del tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa) de los extractos de M. tenuiflora (Mt), E. arvense (Ea), A. vera (Av), S. aromaticum (Sa) y L. graveolens (Lg) a 500 y 1000 ppm. Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano.

Figura 6
Evaluación in vitro del tiempo de tromboplastina parcial activada TPPa de los extractos de M tenuiflora Mt E arvense Ea A vera Av S aromaticum Sa y L graveolens Lg a 500 y 1000 ppm Los datos representan las medias en segundos tomando como control positivo los tiempos de un paciente sano
Fuente: Elaboración propia

Fuente: Elaboración propia

Discusión

De acuerdo con los resultados obtenidos puede concluirse que en la evaluación de la actividad antimicrobiana los resultados de las pruebas demostraron que contra S. mutans los extractos de E. arvense y L. graveolens presentaron mejor efecto inhibitorio en concentraciones de 1000 ppm, además L. graveolens mantuvo su efecto a 500 ppm (p=0.0001). Otros autores ya han mencionado estos resultados anteriormente con los extractos de S. aromaticum y L. graveolens sin encontrar diferencias significativas (p> 0,05) al probar los aceites de eugenol (obtenido del clavo) y timol (obtenido del orégano) a la misma concentración en comparación con clorhexidina al 0.12% tanto a la 24 como 48 horas¹³. Otros autores mencionan que el orégano posee efecto antibacteriano sobre el crecimiento de Streptococcus mutans en infusiones sobre el 20% de concentración¹⁴. En este estudio obtuvimos efecto inhibitorio contra S. mutans y S. sobrinus a las 24 horas similar o superior al obtenido con clorhexidina al 0.12% (1200 ppm) con una diferencia estadística altamente significativa en las diferentes concentraciones. Con respecto a la evaluación de la actividad coagulante/anticoagulante otros autores han investigado la capacidad de algunos extractos vegetales sobre la promoción de la cicatrización de algunas plantas, entre ellas Plantago lanceolata, Equisetum arvense, Potentilla erecta, Artemisia absinthium y Alchemilla vulgaris, cinco especies de plantas medicinales utilizadas tradicionalmente para el tratamiento de hemorragias. Las pruebas hemostáticas realizadas in vitro con extractos hidroalcohólicos de estas plantas revelaron que Plantago lanceolata, Equisetum arvense, Potentilla erecta y Artemisia absinthium tenían un efecto astringente. El estudio mostró que Plantago lanceolata tenía las mejores propiedades coagulantes con una reducción porcentual del tiempo de recalcificación del plasma del 19% sin significación estadística. Artemisia absinthium redujo el tiempo de protrombina (TP), lo que sugiere una activación de la vía de coagulación extrínseca. Todas estas plantas redujeron la actividad de lisis de coágulos de la estrepotoquinasa con diferentes porcentajes, pero Potentilla erecta tuvo la mayor significación. Los resultados de la determinación del TP muestran que Alchemilla vulgaris, Equisetum arvense y Potentilla erecta disminuyeron el TP en diferentes porcentajes, pero sin significancia estadística p>0,05. Los resultados de la determinación de TTPa mostraron que Plantago lanceolata, Alchemilla vulgaris, Artemisia absinthium y Potentilla erecta aumentaron el TTPa en comparación con el control sin significación estadística p>0,05. Solo Equisetum arvense disminuyó el tiempo en comparación con el control, pero sin significancia estadística p>0.05¹⁵. Otros autores estudiaron la relación dosis efecto del extracto de caléndula en lesiones en ratas utilizando varios grupos de tratamiento con dosis crecientes. La duración del seguimiento varió de 6 a 21 días después de las escisiones de piel y los principales resultados medidos en histopatología fueron angiogénesis, composición de colágeno, presencia de células inflamatorias y reepitelización¹⁶. En nuestro estudio, los resultados in vitro demostraron que al medir el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPa) y comparando con los tiempos de un paciente sano se determinó que ninguno de los extractos prolongó de manera estadística significativa los tiempos de coagulación excepto E. arvense a 1000 ppm (P= 0.0415) y S. aromaticum a 1000 ppm (P= 0.048) (p<0,05), los cuales lo elevaron por un segundo pues presentaron ambos tiempos de 13.37seg. En cuanto al valor de TPPa del paciente que fue de 32.63 segundos observamos que en todos los extractos evaluados a 500 y 1000 ppm no existe diferencia significativa con respecto al valor del paciente excepto en M. tenuiflora a 500 ppm con un valor (P=0.0001) (p<0,05) que aumentó los tiempos a 39.17 segundos.

Conclusiones

Después de observar los resultados de la evaluación antimicrobiana y coagulante de los cinco extractos analizados podemos concluir en las diferentes pruebas lo siguiente: E. arvense y L. graveolens son los extractos que muestran el mejor efecto antimicrobiano en los resultados sobre cepas de S. mutans en ambas concentraciones. L. graveolens . A. vera muestran el mejor efecto antimicrobiano en los resultados sobre cepas de S. sobrinus en ambas concentraciones. En el ensayo de coagulación no existe una diferencia estadística significativa entre las concentraciones de los diferentes extractos en las pruebas TP y TTPa al compararlos con el testigo paciente. Observamos que el valor de TP del paciente fue 12.27 segundos, los extractos que aumentaron los tiempos fueron E. arvense y S. aromaticum a 1000ppm que presentaron tiempos de 13.37 segundos. En cuanto al valor TPPa del paciente fue de 32.63 seg y el extracto que presentó el tiempo más aumentado fue M. tenuiflora a 500 ppm que presentó tiempos de 39.17 segundos. Podemos concluir que los extractos anteriormente descritos contienen compuestos químicos que resultan alternativas valiosas contra microorganismos y tratamientos orales, además que es muy importante que la investigación proponga materiales y medicamentos que sean efectivos en los tratamientos para los pacientes y que no representen riesgo para la salud.

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